Neinvazinis prenatalinis tyrimas ir atvejų molekulinė analizė (diplominis)

Kiekvienais metais visame pasaulyje gimsta 3–5 proc. naujagimių su įvairiomis raidos anomalijomis, įskaitant chromosomų skaičiaus ir struktūros pokyčius [64]. Dažniausiai vaisiams nustatoma chromosominė anomalija yra 21 chromosomos trisomija, dar kitaip žinoma kaip Dauno sindromas (serga vienas iš 750 naujagimių) [5]. Rečiau nustatomos 18 (vienas iš 5000 naujagimių) [89] ir 13 chromosomų trisomijos (vienas iš 16000 naujagimių) [88]. Lyties chromosomų aneuploidijos nustatomos vienam iš 400 naujagimių [74]. Dažniausiai 13, 18 ir 21 chromosomų trisomijų kilmė – de novo, retais atvejais anomalijos gali susiformuoti dėl tėvinės kilmės chromosominio persitvarkymo (translokacijos). Rizika vaisiui sirgti 13, 18 ir 21 chromosomų trisomijomis didėja kartu su moters amžiumi [70].

Prenatalinė diagnostika – įvairių praktikos ir diagnostikos priemonių visuma, skirta nustatyti vaisiaus ligoms ir patologinėms būklėms iki gimimo. Visi tyrimų metodai ir procedūros, kurie yra taikomi prenatalinėje chromosomų anomalijų patikroje, vaisiaus atžvilgiu yra skirstomi į neinvazinius ir invazinius [1]. NIPT yra chromosomų anomalijų patikros metodas, paremtas cffDNR tyrimu iš moters kraujo nuo 9–10 nėštumo savaitės. CffDNR yra sudaryta iš trumpų DNR fragmentų, kurie į moters kraujotaką patenka iš išorinio trofoblastinių ląstelių sluoksnio vykstant apoptozei [70]. Atliekant tyrimą yra svarbi FF.  Patikimu tyrimas laikomas, kai FF yra ≥4 proc. (tyrimo tikslumas vertinant FF gali skirtis priklausomai nuo naudojamo metodo). Tyrimo metu nustatoma vaisiaus 13, 18 ir 21 chromosomų trisomijų ir lyties chromosomų aneuploidijų rizika, vaisiaus lytis, galima ištirti vaisių ir dėl kai kurių struktūros arba viso chromosomų rinkinio pokyčių [1]. NIPT metodas yra paremtas naujos kartos sekoskaitos technologija [90].

NIPT yra tikslus nustatant 13, 18 ir 21 ir lyties chromosomų skaičiaus pokyčius. Literatūros duomenimis, klaidingai teigiami NIPT rezultatai sudaro 0,3 proc., klaidingai neigiami 0,01 proc., rezultatai negaunami 0,3–5,4 proc. visų tiriamų atvejų [61]. Dažniausiai nustatomų klaidingai teigiamų NIPT rezultatų biologinė priežastis yra citotrofoblastų arba ne citotofoblastų kilmės cfDNR frakcijos padidėjimas moters kraujyje. Išskiriami su tuo susiję biologiniai veiksniai: placentos mozaikiškumas, moters kariotipo mozaikiškumas, nykstantis dvynys, organų transplantacija iš vyriškos lyties donoro, ankstyva moters naviko stadija, vienatėvė disomija. Klaidingai neigiamiems tyrimų rezultatams turi įtakos placentos mozaikiškumas. Šiuo atveju neigiamas NIPT rezultatas gaunamas dėl nepakitusių citotrofoblastų išskiriamos cffDNR į moters kraują. Nenustačius klaidingai teigiamą arba neigiamą NIPT rezultatą lėmusios biologinės priežasties, tikėtina, jog klaidingą rezultatą galėjo sąlygoti techninis veiksnys. Magistro darbo metu savarankiškai atlikti darbai: tyrimo metodų, skirtų nustatyti aneuploidijoms, įsisavinimas; prenatalinių mėginių atranka; žaliavinių duomenų iš ,,GeneMapper“ v3.7 programinės įrangos analizė; molekulinių, molekulinių citogenetinių ir citogenetinių tyrimo rezultatų palyginimas; sutampančių ir nesutampančių neinvazinių ir skirtingų neinvazinių tyrimų rezultatų palyginimas ir atvejų analizė.

Darbo aktualumas. NIPT – tikslus neinvazinis prenatalinis tyrimas, kurio didelis jautrumas ir specifiškumas nustatant 13, 18, 21 ir lyties chromosomų aneuploidijas, sumažina invazinių procedūrų skaičių 89 proc. [90]. Tyrimo metu papildomai galima nustatyti 1p36, 4p16.3 (Wolf–Hirschhorn sindromas), 5p15.2 (Cri–du–chat sindromas), 15q11.2 (Prader–Willi/Angelman sindromas), 22q11.2 (DiGeorge sindromas) chromosominių sričių mikrodelecijų riziką ir kitas retas autosomų aneuploidijas, bei kai kurių genų mutacijas lemiančias monogenines ligas. NIPT yra paremtas cffDNR tyrimu iš moters kraujo ir gali būti atliekamas nuo 9–10 nėštumo savaitės. Dėl įvairių biologinių ir techninių veiksnių sąlygoto cfDNR ir cffDNR moters kraujyje kiekio svyravimo išlieka tikimybė gauti klaidingai teigiamą (0,3 proc.) arba neigiamą (0,01 proc.) tyrimo rezultatą [61], tačiau ji yra mažesnė nei taikant kitus neinvazinius prenatalinius patikros metodus [63]. Šio magistrinio darbo metu pirmą kartą Lietuvoje buvo bandoma išsiaiškinti klaidingai teigiamų NIPT rezultatų priežastis jas lyginant su literatūroje aprašomais duomenimis ir apskaičiuoti klaidingai teigiamų NIPT rezultatų dažnį. Darbe pateikiama schema, galinti padėti nustatyti klaidingus NIPT tyrimų rezultatus sąlygojusius biologinius veiksnius.   

Darbo problematika. NIPT didelės rizikos tyrimų rezultatus būtina patvirtinti atliekant invazinius diagnostinius tyrimus. 0,3 proc. atvejų didelės rizikos NIPT rezultatai nesutampa su invaziniais tyrimų metodais gautais rezultatais [61]. Literatūros duomenimis, klaidingai teigiamų NIPT rezultatų biologinės ir techninės priežastys nustatomos 33 proc. visų atvejų [72]. Nenustačius biologinio arba techninio rezultatą sąlygojusio veiksnio, klaidingo NIPT rezultato priežastis lieka neišaiškinta. NIPT tyrimų rezultatai negaunami 0,3–5,4 proc. visų atvejų [61].

Darbo tikslas. Atlikti nesutampančių NIPT ir invazinių tyrimų rezultatų analizę, įvertinti nesutapimus ir jų galimas priežastis.

Darbo uždaviniai:

1. Atrinkti moterų, kurioms 2016 m. gruodžio – 2020 m. vasario mėn. VUL SK MGC buvo paskirti NIPT tyrimai, paimtus prenatalinius mėginius.
2. Išanalizuoti atrinktų prenatalinių mėginių molekulinių, molekulinių citogenetinių ir citogenetinių tyrimų rezultatus.
3. Išanalizuoti moterų, kurių prenataliniai mėginiai buvo atrinkti analizei, citogenetinių tyrimų rezultatus.  
4. Palyginti atrinktų moterų NIPT, citogenetinių ir prenatalinių mėginių molekulinių, molekulinių citogenetinių ir citogenetinių tyrimų rezultatus.
5. Atlikti atvejų, kurių neinvazinių ir invazinių tyrimų rezultatai nesutampa, analizę.
6. Sukurti padidintos aneuploidijų rizikos NIPT rezultatų tikslinimo schemą, galinčią padėti nustatyti klaidingus NIPT tyrimų rezultatus sąlygojusius biologinius veiksnius.