PGR variacijos. Kiti in vitro amplifikacijos metodai

Tikro laiko (real time) PGR. PGR eigoje, kiekvieno ciklo metu yra matuojama fluorescencija, kuri yra proporcinga susintetintos DNR kiekiui. Tačiau yra nustatomas ne DNR kiekis, o laiko momentas (kurio ciklo metu), kada susidarė produktas (tam tikras jo kiekis). Šis metodas dar vadinamas kiekybine PGR, kadangi galima nustatyti absoliutų DNR kiekį, DNR kopijų skaičių, o taip pat ir santykinį nukleorūgščių kiekį tiriamuose mėginiuose. Jis yra labai svarbus tiriant genų raišką. Tikro laiko PGR naudojama:• genų raiškos nustatymui• genų raiškos kiekybiniam įvertinimui• DNR kopijų skaičiaus nustatymui• mutacijų nustatymui• vieno nukleotido skirtumų nustatymuiMatuojant susidariusio produkto kiekį atitinkančią fluorescenciją tikro laiko PGR metu, yra stebima, kad iš pradžių fluorescencija nekinta. Fluorescencijos lygis, kuris paprastai per pirmus 15 ciklų, yra prilyginamas bazinei linijai. Tuo metu PGR produktų kiekis yra per mažas, kad būtų galima nustatyti. Vėliau, eksponentiškai daugėjant PGR produktų, fluorescencija pasiekia tam tikrą slenkstinę ribą ir toliau eksponentiškai didėja. Ciklo numeris, kurio metu fluorescencija pasiekia slenkstinę ribą, vadinamas CT arba slenkstiniu ciklu. Vėliau PGR efektyvumas mažėja – pereinamoji fazė, o po to PGR produkto kiekis beveik nebekinta – „plato“ fazė. Nustatytas CT kiekis priklauso nuo mėginyje esančios DNR kopijų skaičiaus. Kuo daugiau yra taikinio DNR, tuo mažesnis yra CT, tuo greičiau DNR yra padauginama ir fluorescencija pasiekia slenkstinį lygį. Susidariusios DNR kiekis nustatomas matuojant fluorescenciją. Naudojamos medžiagos, kurių fluorescencija, susijungus su dvigrande DNR, padidėja, DNR zondų sistemos, kuriom prisijungus prie taikinio DNR fluorescencija išauga arba specialių struktūrų pradmenys, kuriems atsiradus amplifikono sudėtyje, jų fluorescencija išauga. Tam, kad tiksliai būtų įvertinta mėginių fluorescencija, dažnai į mėginius pridedama standartinio inertiško fluoroforo.