RNR ir oligonukleotidų taikymas genų terapijoje

Genų terapija – tai eksperimentinis gydymas, kuris atliekamas įvedant naują koduojančią ar ne genetinę medžiagą į asmens ląsteles. Nauja genetinė medžiaga gali pakeisti pakitusį, savo funkcijos neatliekantį, geną arba nuslopinti pakitusio geno raišką organizme. Tai atliekama siekiant gydyti ar išvengti ligos (Shum, Rossi, 2015).

Pirmuoju genų terapijos atveju, dažniausiai į organizmą yra įvedama DNR molekulė. Nuoga DNR dėl savo dydžio, hidrofilinės prigimties, neigiamai įkrautų fosfatų grupių, degraduojančio nukleazių poveikio negali efektyviai patekti į ląsteles. Dėl minėtų priežasčių, pernešimui yra naudojami specialūs nešėjai, tokie kaip vektoriai, kurių uždavinys nepažeistą genetinę medžiagą nunešti į tikslinę vietą. Vektoriai gali būti virusinės ir ne virusinės kilmės. Vektoriai turi pasižymėti: efektyvumu, specifiškumu, saugumu, grynumu, stabilumu, tiksliniu pristatymu ir šalutinių efektų nebuvimu (Thomas et al, 2003).

Kita genų terapijos kryptis yra įvesti į organzimą nekoduojančią genetinę medžiagą, kuri reguliuoja genų raišką. Yra žinoma daug metodų, kurių metu yra panaudojami nekoduojantys oligonukleotidai: mažos interferuojančios RNR, antiprasminiai oligonukleotidai, aptamerai, ribozimai (Shum, Rossi, 2015). Būtent šie nekoduojantys oligonukleotidai, jų veikimo mechanizmai ir genų terapijos klinikinis pritaikymas bei perspektyvos bus aprašomos šiame referate.

Nekoduojančios nukleorūgštys ir jų veikimo mechanizmai organizme

Nekoduojantys ologonukleotidai yra nukleorūgštys, turinčios mažiau nei 100 bazių porų. Lyginant su tradicinėmis baltymus koduojančiomis RNR molekulėmis, nekoduojantys oligonukleotidai nekaupia genetinės informacijos, tačiau dalyvauja įvairiuose specifiniuose ir kombinuotuose biologinių sistemų genų reguliacijos mechanizmuose. Priklausomai nuo dydžio ir atliekamos funkcijos jie yra skirstomi į mikroRNR (miRNR), snoRNR, ilgasias nekoduojančias RNR, piwi RNR. Šie oligonukleotidai dalyvauja genetiniuose ir epigenetiniuose procesuose, yra susiję vėžio ir kitų žmonių ligų, tokių kaip širdies ir kraujagyslių, autoimuninių, neurologinių ir vystymosi. Kadangi šių nukleorūgščių pirminė funkcija yra susijusi su genų reguliacija, jos puikiai gali būti pritaikomos gydymo tikslais (Shum, Rossi, 2015).

Mažosios RNR

Mažosioms RNR priskiriamos mažosios interferuojančios RNR (siRNR) ir mikroRNR (miRNR). Jos nekoduoja baltymų aminorūgščių sekos, o dalyvauja genų raiškos reguliacijoje. Atsižvelgiant į jų veikimo mechanizmus ir atskleistas dideles pritaikomumo galimybes, jos gali būti panaudojamos kaip genų terapijos įrankis siekiant gydyti platų ligų spektrą. Jau yra pradėti šių molekulių kaip galimų vaistų klinikiniai bandymai.

siRNR ir miRNR turi daug tiek sintezės, tiek struktūrinių, tiek veikimo panašumų. Tačiau skirtumai atsiranda potranskripsinio taikinio – informacinės RNR pasirinkime. Tai lemia skirtingą jų klinikinės programos pritaikymą (Lam et al, 2015).

miRNR sintezė ir veikimo mechanizmas

Mikro RNR (miRNR) yra mažų, apie 19 – 25 nukleotidų ilgio, nekoduojančių RNR molekulių grupė. Ji reguliuoja genų raišką po transkripcijos, prisijungdama prie 3’UTR, koduojamos sekos ar 5’ UTR taikinių informacinėje RNR (iRNR) įvariose eukariotų ląstelėse bei audiniuose. Šis prisijungimas lemia arba transliacijos sustabdymą, arba iRNR degradaciją.

miRNR transkripcijoje, kaip ir iRNR, dažniausiai dalyvauja RNR II polimerazė. miRNR yra perrašomos kaip ilgi, turintys plaukų segtukų struktūras, pirminiai transkriptai (pri - miRNR), kurie yra sudaryti iš kelių nukleotidų kilobazių, turinčių branduolio fermento III Rnazės Drosha ir kofaktoriaus DGCR8 (ang. DiGeorge syndrome critical region gene 8) atpažinimo vietas. Šis baltymų kompleksas sukarpo pri – miRNR, atskirdamas segtukus vieną nuo kito. Šie apie 70 nukleotidų ilgio dariniai vadinami pre – miRNR, 3‘ gale turintys 2 nukleotidų išsikišimą. Atitinkamo dydžio intronai taip pat gali suformuoti panašią į pri - miRNR plaukų segtuko struktūrą. Tuomet dėl splaisingo gali susiformuoti pre – miRNR.

Pre – miRNR pernešti iš branduolio į citoplazmą padeda branduolio eksporto veiksnys Eksportinas – 5 (Exp - 5) ir RanGTPazė. Exp – 5 stabilizuoja (apsuka maža spirale) pre – miRNR, kuri, Ran hidrolizuojant GTP į GDP, yra pernešama per branduolio porą.

Citoplazmoje pre – miRNR yra iš karto verčiama į subrendusią miRNR. Visų pirma, pre – miRNR jungiasi su RISK pakrovimo kompleksu (RPK), kurį sudaro RNazė Dicer, Ago ir TRBP (ang. Tar RNA Binding Protein). RPK kerpa pre – miRNR kilpą, palikdama 19 – 25 nukleotidų dupleksą, kurio 3‘ gale vis dar lieka išsikišę 2 nukleotidai. Nukirpus kilpą, Dicer ir TRBD pasišalina, susiformuoja dviguba miRNR. Iš šios viena nestabili grandinė degraduoja, o kita miRNR jungiasi su Ago baltymu ir tampa subrendusia bei funkcionalia. Kuri grandinė degraduos, nusprendžia Dicer baltymo helikazės domenas. Jis veikia kaip termodinamikos asimetrijos jutiklis ir parenka jautresnę ir nestabilesnę, turinčią 5‘ galą miRNR jungtis su Ago baltymu. Galiausiai jungiasi GW182 šeimos baltymai, būtini transliacijos slopinimui, deadenilinimui bei miRNR taikinių irimui. Šis susiformavęs RISK kompleksas jungiasi prie iRNR 3‘ UTR vietos ir slopina baltymo transliaciją (1 paveikslėlis) (Vimalraj et al., 2012).