Katalogas
Medicina

Šakotos grandinės aminorūgščių metabolizmo įtaka navikinių ląstelių funkcijoms

Diplominis darbas
44 psl. / 9000 žod.
0 atsiliepimų

Ištrauka

Šakotos grandinės aminorūgštys (BCAA), įskaitant leuciną, izoleuciną ir valiną, yra nepakeičiamos aminorūgštys, kurios atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį baltymų sintezėje ir energijos gamyboje. Navikinėms ląstelėms jos gali būti gaunamos iš naviko mikroaplinkos arba skaidant baltymus. BCAA metaboliniai fermentai, tokie kaip citozolinė šakotos grandinės aminorūgščių transferazė 1 (BCAT1) ir mitochondrinė šakotos grandinės aminorūgščių transferazė 2 (BCAT2), yra naudingi naviko žymenys. Taigi šio darbo metu buvo analizuojama, kaip BCAT2 geno nutildymas gali sutrikdyti navikinių ląstelių energijos ciklą. Taip pat tyrimo tikslas buvo išsiaiškinti kokią įtaka turėjo navikinių ląstelių gyvybingumui, mitochondrijų membranos potencialui ir baltymų raiškai BCAT2 geno slopinimas.

Tyrimams buvo pasirinktos dvi krūties naviko ląstelių linijos – MCF-7 ir BCC, kurios buvo auginamos įprastoje ir skirtingose sumažintos koncentracijos šakotos grandinės aminorūgščių terpėse, su pridėtu 3-metil-2-oksobutano rūgšties (MOB) BCAA skaidymo kelio metabolitu. Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas ląsteles nudažius aneksinu V ir 7-aminoaktinomicinu D (7-AAD), o mitochondrijų membranų potencialo tyrimai buvo atlikti naudojant 5,5'6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazololkarbocianino jodido (JC-1) dažą. Šie rezultatai gauti panaudojant tėkmės citometriją. BCAT2 baltymo raiška buvo keičiama transfekcijos metodu, nutildymui naudojant siRNR prieš BCAT2 geną. BCAT2 baltymo kiekis nustatytas imunoblotingo metodu.

Gauti rezultatai rodo, kad BCAA metabolizmas turi didelės įtakos navikinių ląstelių gyvybingumui. Taip pat atliktų tyrimų metu buvo vertinamas metabolito MOB poveikis ląstelėms. Gauti rezultatai parodė, kad šakotos grandinės aminorūgštys turi didelės reikšmės ląstelių gyvybingumui, nes ląstelių augintų sumažintos koncentracijos 0,4 mM BCAA terpėje, tiek transfekuotų siRNR prieš BCAT2, tiek papildytoje metabolitu – MOB, gyvybingumas buvo ženkliai didesnis lyginant su kitose terpėse augintomis ląstelėmis.

Taip pat šioje terpėje ankstyvos ir vėlyvos apoptozės stadijos ląstelių kiekis buvo ženkliai mažesnis, lyginant su kitomis sąlygomis augintomis ląstelėmis.

Atlikti tyrimai, kurių metu stebimi navikinių ląstelių mitochondrijų membranos potencialo pokyčiai augintų skirtingose terpėse, taip pat ląstelių atsakas į MOB poveikį ar BCAT2 baltymo raiškos pokyčius. Rezultatai parodė, kad didžiausias Δψm matomas BCC ląstelėse po nutildymo siRNR prieš BCAT2 geną, kai terpė papildyta MOB. MCF-7 ląstelių linijoje Δψm labiausiai padidėjo po BCAT2 geno nutildymo 0,4 mM BCAA terpėje.

BCAT2 baltymo raiškos pakitimai buvo vertinami, panaudojus siRNR nutildymą prieš BCAT2 skirtingose auginimo terpėse bei su MOB priedu. Išanalizavus gautus duomenis, stebima didelė BCAT2 baltymo raiška BCC ląstelių linijoje. MOB priedas įprastoje DMEM/F12 terpėje augintose MCF-7 ląstelėse padidina BCAT2 baltymo raišką net po nutildymo. Po nutildymo su siRNR, BCAT2 raiška abiejų ląstelių linijose sumažėja, tačiau pridėjus į terpę su transfekuotomis ląstelėmis MOB, baltymo kiekis dalinai atsistato

Turinys

  •  
  • SANTRUMPOS4
  • SANTRAUKA6
  • SUMMARY8
  • DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI10
  • ĮVADAS11
  • LITERATŪROS APŽVALGA13
  • 1.1      Šakotosios grandinės aminorūgščių biochemija ir katabolizmas13
  • 1.2      Šakotosios grandinės aminorūgščių metabolizmas navikinėse ląstelėse14
  • 1.3      Šakotos grandinės aminorūgščių vaidmuo epigenetiniame reguliavime15
  • 1.4      MCF-7 krūties naviko ląstelių linija17
  • 1.5      BCC krūties naviko ląstelių linija18
  • 1.6      Genų nutildymas naudojant siRNR18
  • 1.7      Ląstelių tyrimai naudojant tėkmės citometrą20
  • 1.8      Navikinių ląstelių gyvybingumo ir proliferacijos tyrimai20
  • 1.9      Mitochondrijų membranos potencialo tyrimai22
  • TYRIMO METODIKA25
  • 2.1      Ląstelių linijos ir jų kultivavimas25
  • 2.2      siRNR transfekcija26
  • 2.3      Tėkmės citometrija26
  • 2.4      Baltymų išskyrimas27
  • 2.5      Baltymų imunoblotingas27
  • 2.6      Statistinė duomenų analizė28
  • REZULTATAI29
  • 3.1      Ląstelių gyvybingumas po BCAT2 nutildymo29
  • 3.2      Mitochondrijų membranos potencialo pokyčiai po BCAT2 geno nutildymo31
  • 3.3      Baltymų raiškos tyrimai po BCAT2 geno slopinimo33
  • REZULTATŲ APTARIMAS37
  • IŠVADOS39
  • LITERATŪROS SĄRAŠAS40
  • 7.                         PRIEDAI44

Literatūros sąrašas


  1. Ananieva EA, Wilkinson AC. Branched-chain amino acid metabolism in cancer. T. 21, Current opinion in clinical nutrition and metabolic care. Lippincott Williams and Wilkins; 2018. p. 64–70.

  2. Sivanand S, vander Heiden MG. Emerging roles for branched-chain amino acid metabolism in cancer. T. 37, Cancer Cell. Cell Press; 2020. p. 147–56.

  3. Nie C, He T, Zhang W, Zhang G, Ma X. Branched chain amino acids: beyond nutrition metabolism. T. 19, International journal of molecular sciences. MDPI AG; 2018.

  4. ŞERBAN COMŞA, ANCA MARIA CÎMPEAN, MARIUS RAICA. The story of MCF-7 breast cancer cell line: 40 years of experience in research. Anticancer Res. 2015;(35):3147–54.

  5. Lee JH, Cho Y ra, Kim JH, Kim J, Nam HY, Kim SW, ir kt. Branched-chain amino acids sustain pancreatic cancer growth by regulating lipid metabolism. Exp Mol Med. 2019 lapkr 1;51(11).

  6. Antanaviěiute I, Mikalayeva V, Cesleviěiene I, Milašiute G, Skeberdis VA, Bordel S. Transcriptional hallmarks of cancer cell lines reveal an emerging role of branched chain amino acid catabolism. Sci Rep. 2017;7(1).

  7. Jung MK, Okekunle AP, Lee JE, Sung MK, Lim YJ. Role of branched-chain amino acid metabolism in tumor development and progression. J Cancer Prev. 2021 gruodž 30;26(4):237–43.

  8. Neinast M, Murashige D, Arany Z. Branched chain amino acids. T. 81, Annual Review of Physiology. Annual Reviews Inc.; 2019. p. 139–64.

  9. Shimomura Y, Murakami T, Nakai N, Nagasaki M, Harris RA. 3rd Amino acid workshop exercise promotes BCAA catabolism: effects of BCAA supplementation on skeletal muscle during exercise

  10. Zhang L, Han J. Branched-chain amino acid transaminase 1 (BCAT1) promotes the growth of breast cancer cells through improving mTOR-mediated mitochondrial biogenesis and function. Biochem Biophys Res Commun. 2017 bal 29;486(2):224–31.

  11. Harris RA, Joshi M, Jeoung NH. Mechanisms responsible for regulation of branched-chain amino acid catabolism. Biochemical and Biophysical Research Communications. Academic Press Inc.; 2004. p. 391–6.

  12. Holeček M. Branched-chain amino acids in health and disease: Metabolism, alterations in blood plasma, and as supplements. T. 15, Nutrition and Metabolism. BioMed Central Ltd.; 2018.

  13. Kaelin WG, McKnight SL. Influence of metabolism on epigenetics and disease. T. 153, Cell. Elsevier B.V.; 2013. p. 56–69.

  14. Campbell SL, Wellen KE. Metabolic signaling to the nucleus in cancer. T. 71, Molecular Cell. Cell Press; 2018. p. 398–408.

  15. Pietrocola F, Galluzzi L, Bravo-San Pedro JM, Madeo F, Kroemer G. Acetyl coenzyme A: A central metabolite and second messenger. T. 21, Cell Metabolism. Cell Press; 2015. p. 805–21.

  16. Lei MZ, Li XX, Zhang Y, Li JT, Zhang F, Wang YP, ir kt. Acetylation promotes BCAT2 degradation to suppress BCAA catabolism and pancreatic cancer growth. Signal Transduct Target Ther. 2020 gruodž 1;5(1).

  17. Shafei MA, Flemban A, Daly C, Kendrick P, White P, Dean S, ir kt. Differential expression of the BCAT isoforms between breast cancer subtypes. Breast Cancer. 2021 geg 1;28(3):592–607.

  18. Kathryn R. Coser, ben S. Wittner, Noe ̈ l F. Rosenthal, Sabrina C. Collins, Antonia Melas, Shannon L. Smith, ir kt. Antiestrogen-resistant subclones of MCF-7 human breast cancer cells are derived from a common monoclonal drug-resistant progenitor. T. 106. 2009 rugpj.

  19. Nugoli M, Chuchana P, Vendrell J, Orsetti B, Ursule L, Nguyen C, ir kt. Genetic variability in MCF-7 sublines: evidence of rapid genomic and RNA expression profile modifications. 2003.

  20. Deborah L Holliday, Valerie Speirs. Choosing the right cell line for breast cancer research. 2011;

  21. Mikalayeva V, Pankevičiūtė M, Žvikas V, Skeberdis VA, Bordel S. Contribution of branched chain amino acids to energy production and mevalonate synthesis in cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 2021 gruodž 31;585:61–7.

  22. Boonanuntanasarn S, Yoshizaki G, Takeuchi T. Specific gene silencing using small interfering RNAs in fish embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2003 spal 31;310(4):1089–95.

  23. Agrawal N, Dasaradhi PVN, Mohmmed A, Malhotra P, Bhatnagar RK, Mukherjee SK. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2003 gruodž;67(4):657–85.

  24. Lam JKW, Chow MYT, Zhang Y, Leung SWS. siRNA versus miRNA as therapeutics for gene silencing. T. 4, Molecular Therapy - Nucleic Acids. Nature Publishing Group; 2015. p. e252.

  25. Rėda Matuzevičienė. TĖKMĖS CITOMETRIJA IR JOS TAIKYMAS LABORATORINĖJE MEDICINOJE. Vilnius; 2013.

  26. Brown M, Wittwer C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. 2000.

  27. Kamiloglu S, Sari G, Ozdal T, Capanoglu E. Guidelines for cell viability assays. Food Front. 2020 rugs 1;1(3):332–49.

  28. Stoddart MJ. Cell viability assays: introduction. Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc.; 2011. p. 1–6.

  29. Lizarbe MA, Barrasa JI, Olmo N, Gavilanes F, Turnay J. Annexin-phospholipid interactions. Functional implications. T. 14, International Journal of Molecular Sciences. 2013. p. 2652–83.

  30. Zembruski NCL, Stache V, Haefeli WE, Weiss J. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 2012 spal 1;429(1):79–81.

  31. Bading JR, Shields AF. Imaging of cell proliferation: status and prospects. T. 49, Journal of Nuclear Medicine. 2008.

  32. Chung S, Kim SH, Seo Y, Kim SK, Lee JY. Quantitative analysis of cell proliferation by a dye dilution assay: Application to cell lines and cocultures. Cytometry Part A. 2017 liep 1;91(7):704–12.

  33. Sakamuru S, Attene-Ramos MS, Xia M. Mitochondrial membrane potential assay. Methods in Molecular Biology. 2016;1473:17–22.

  34. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, Brown EB, Gelbard HA. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: A practical usage guide. T. 50, BioTechniques. 2011. p. 98–115.

  35. Hagiwara A, Nishiyama M, Ishizaki S. Branched-chain amino acids prevent insulin-induced hepatic tumor cell proliferation by inducing apoptosis through mTORC1 and mTORC2-dependent mechanisms. J Cell Physiol. 2012 geg;227(5):2097–105.

  36. Zhang B bei, Wang D gang, Guo F fen, Xuan C. Mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in cancer stem cells. T. 14, Familial Cancer. Kluwer Academic Publishers; 2015. p. 19–23.

  37. Biswas D, Slade L, Duffley L, Mueller N, Dao KT, Mercer A, ir kt. Inhibiting BCKDK in triple negative breast cancer suppresses protein translation, impairs mitochondrial function, and potentiates doxorubicin cytotoxicity. Cell Death Discov. 2021 gruodž 1;7(1).

Reziumė

Autorius
woops
Tipas
Diplominis darbas
Dalykas
Medicina
Kaina
€10.95
Lygis
Universitetas
Įkeltas
Bal 23, 2023
Publikuotas
2023 m.
Apimtis
44 psl.

Ne tai, ko ieškai?

Išbandyk mūsų paiešką tarp daugiau nei 16600 rašto darbų

Susiję darbai

Sąkandžio anomalijų įtaka apnašo kaupimuisi

Medicina Diplominis darbas 2014 m. talandzeviciute
Temos aktualumas: Sveikata tai pastovių diskusijų objektas, kuris įtraukia vis daugiau specialistų, kurie stengiasi išsaugoti, puoselėti ir palaikyti kuo geresnę mūsų sveikatos būklę....
Peržiūrėti
Atsisiųsti (€10.95)